Raporty IChTJ. Seria A nr 3/2004




RODNIKI POWSTAJĄCE W DNA I JEGO NUKLEOTYDACH POD WPŁYWEM PROMIENIOWANIA JONIZUJĄCEGO
(RADICALS OF DNA AND DNA NUCLEOTIDES GENERATED BY IONISING RADIATION)

Grażyna Przybytniak

Reakcje rodnikowe DNA stanowią pierwszy etap wielu procesów komórkowych, w następstwie których powstają uszkodzenia materiału genetycznego organizmów. W przeprowadzonych badaniach modelowych tego typu przemiany inicjowano promieniowaniem jonizującym, które prowadzi do utraty albo pozyskania elektronu przez substrat i powstania jonowych produktów rodnikowych. Metodą niskotemperaturowej spektroskopii EPR stwierdzono, że w nukleotydach stanowiących monomeryczne podjednostki DNA, po wychwycie elektronu i utworzeniu anionorodnika, zachodzi w następstwie proto-nowania separacja ładunku i niesparowanego spinu. Pierścienie purynowe wykazują tendencję do przyłączania protonu do atomu węgla C8, co potwierdzono jednoznacznie dla guaniny wykorzystując efekt izotopowy. W ten sam sposób po raz pierwszy zidentyfikowano produkt podwójnego protonowania anionorodnika guaniny, nieodwracalnego przy C8 i odwracalnego przy endocyklicznym atomie azotu N7 pierścienia imidazolowego. Udowodniono, że protonowanie grupy aminowej anionorodnika cytozyny zapobiega reakcjom protolizy z udziałem atomów węgla pierścienia pirymidyny. Kationorodniki, które powstają w następstwie utraty elektronu przez cząsteczkę, są w 77 K trwałe tylko dla nukleotydów guaniny i adeniny. Część z nich osiąga stabilizację poprzez uwolnienie jednego z protonów deoksyrybozy. Natomiast w kationorodniku tyminy grupa karbonylowa ułatwia oderwanie protonu z sąsiedniego podstawnika metylowego prowadząc do powstania rodnika typu allilowego.
W zamrożonych roztworach wodnych DNA, w pierwszym etapie radiolizy, powstają anionorodniki pirymidyn i kationorodnik guaniny. Wykazano, że elektrony zlokalizowane na cytozynie nie są przenoszone do tyminy w wyniku termicznej aktywacji, co stanowi pośredni dowód na szybkie protonowanie anionorodnika cytozyny w obrębie pary komplementarnej. Metodą dichroizmu kołowego i liniowego stwierdzono, że jony żelaza(III) powodują sil-ne zaburzenie helikalnej struktury DNA świadczące o koordynacji Fe(III) z zasadami azotowymi. Taka lokalizacja akceptora elektronów ułatwia ich dalekozasięgowe przeniesienie, nawet na odległość kilkudziesięciu par zasad. Natomiast przebieg procesów rodnikowych w DNA indukowanych promieniowaniem jonizującym w obecności tioalkoholi zależy od ich ładunku. W 77 K międzycząsteczkowe przeniesienie dziury z DNA do tioalkoholu jest możliwe wówczas, gdy dodatni ładunek tioalkoholu, np. cysteaminy, wiąże go ściśle z polianionową biocząsteczką. Natomiast naprawy rodników powstających w wyniku radiacyjnego utleniania DNA, tj. kationorodnika gua-niny oraz rodnika tyminy typu allilowego, zachodzą z udziałem grup sulfanylowych w wyższych temperaturach, a wpływ ładunku tioalkoholu nie jest czynnikiem decydującym o procesie.



A first stage of many cell processes leading to DNA damage is initiated by radical reactions. In a model system such transformations were generated by ionising radiation which involves production of electron loss and electron gain centres of the substrate and radical ion formation. Using cryogenic EPR spectroscopy it was found that the DNA nucleotides, which convert to radical anions upon electron capture undergo the separation of unpaired spin and charge due to protonation. Purines show a tendency towards proton attachment to carbon atom C8, which was unambiguously confirmed for the guanine radical anion by the isotope effect. Its double-protonated product, irreversibly at C8 and reversibly at endocyclic nitrogen N7 of imidazole, were identified for the first time by replacing both protons with deuterons. It has been proved that the protonation of the amino group protects cytosine radical anions from the participation of their carbon atoms in protolytic reactions. Radical cations formed in nucleotides from the electron loss centres are stable at 77 K only for guanine and adenine. Both intermediates partly undergo deprotonation at deoxyribose moiety. Unlike purines, the thymine radical cation loses proton exclusively from its methyl substituent as a result of influence of neighbouring carbonyl group.
The first stage of DNA radiolysis involves the generation of pyrimidine radical anions and guanine radical cations in frozen aqueous solutions. It has been confirmed that electron localised on cytosine is not transferred upon thermal annealing to thymine, which gives indirect evidence of the protonation of the cytosine radical anions in the complementary base pairs. Circular and linear dichroism studies enabled to conclude that iron ions(III) induce strong changes in the DNA helical structure indicating their coordination with nitrogen bases. Such a binding facilitates long-distance electron transfer even through a few dozen base pairs. On the other hand, processes induced by ionising radiation in the presence of thioalcohols depend on the charge of their molecules. The intermolecular hole transfer from DNA to thioalcohol proceeds at 77 K, only if the positively charged thiol, e.g. cysteamine, is strongly bonded with polyanionic biomolecule. The repair of DNA radicals produced via radiolytic oxidation, i.e. the guanine radical cation and the allyl type radical of thymine, is possible at elevated temperatures due to the involvement of sulphydryl groups. The influence of the thiol charge is then limited.